《少女爱上姐姐》讲述宫小路瑞穗（堀江由衣 配音）是个地地道道的男孩子，可是由于祖父的奇怪遗言，他即将转学到圣央女学院开始新的学习生活。祖父的用意为何？瑞穗完全不知道。圣央女学院是一所完全的女校，有其严明的校风和校规，是女孩子们学习如何成为一名真正淑女的宝地。对于从小就接受着良好教育的瑞穗来说，这一切都不是问题。唯一困扰着他的，是如何打扮成女生而不被发现，和怎样应付周围那一群如花似玉的大小姐。成熟端庄的十条紫苑（松来未佑 配音），单纯善良的周防院奏（神田朱未 配音），活泼好动的御门玛利亚（浅野真澄 配音），傲娇腹黑的严岛贵子（高桥智秋 配音），在这些可爱女孩的围绕下，想要守住身为男孩的秘密对于瑞穗来说几乎是不可能完成的任务。